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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸突显组学、LC-MS/MS磷过酸位点讲解技术服务。
英语子标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
常常问题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
朋友的单位：山东大学
探究物料：拟南芥侧根
拜谱提供了技能：磷酸性反应装饰组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点研究分析
调查思维：
PART 01 探究但是
01、生长发育素推进VIK的磷酸性反应简述转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷硝化作用蛋清质类物质析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 种子发芽素带动VIK的磷过酸以及转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化检测。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过发酵粉双杂交育种了解（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶相辅相成三维成像实验报告（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体磷硝化作用实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时交通定量分析PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素表现主动性调整 LR 健康成长
完成解析3个VIK T-DNA插进变异体（vik-2和vik-3），发觉与纯天然型比起，变异体的LR硬度、LR原基（LRP）和已发展大的LR有效极大减少，越发是vik-2（图2）。反着的，过把你想表达出来出来VIK的转遗传人类基因植物情况出LR硬度加强。再者，在vik-2变异体背景图案下把你想表达出来出来VIK的转遗传人类基因植物恢复原状了LR发展大瑕疵。发展素补救测试表面，vik-2变异体对发展素介导的LR发展大影响减小，表面VIK在发展素调空LR发展大中起的关键使用。 
图2 VIK介导的出现素电磁波通道正面政策调控LR的骨骼发育
03、VIK 与ERF13 来进行生物学交互设计
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双分子结构荧光互替 （BiFC）和免役共沉垫实验报告（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13相互之间角色
04、VIK以双面馈的措施控制ERF13磷酸性反应
通过磷过酸蛋白酶组学分折，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点基因变异表明显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈习惯磷酸性反应ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应提高ERF13可降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体之外进行实验英文和人体进行实验英文，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模似和磷酸灭活变化体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚细胞膜追踪定位具体分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷过酸加快速度了ERF13化学降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷硝化作用上下调整 LR 的出现了
研究方案进步刍议了VIK控制的ERF13生物化学降解在侧根（LR）发育状况中的反应。凭借相比各不相同转遗传基因植被系的LR表型，得知过显示方法ERF13治理和改善了LR的冒出，在vik基因遗传变异体中此类治理和改善反应明显增强，而在过显示方法YFP-VIK的的背景下此类治理和改善反应减小（图6）。除此以外，相比ERF13的各不相同磷酸性反应仿真系统和磷酸解离遗传变异体的过显示方法植被系，得知ERF132A-Myc（磷酸解离）的植被系LR冒出很少，而ERF132D-Myc（磷酸性反应仿真系统）的植被系LR冒出略多。以上结局显示，VIK介导的ERF13磷酸性反应和生物化学降解增强了LR的冒出。 
图6 VIK介导的ERF13磷碱化加速LR的发生
07、VIK在侧根發育中磷酸性反应并安全稳定LBD18核蛋白
依据讲解两种VIK T-DNA放变动体（vik-2和vik-3），发现与野外型相较于，变动体的侧根（LR）导热系数、LR原基（LRP）和已阴茎健康的LR相关性以减少，更是是vik-2（图7）。相对来说，过表达爱爱VIK的转什么是染色体植物体主要表现出LR导热系数增大。除此以外，在vik-2变动体时代背景下表达爱爱VIK的转什么是染色体植物体完全恢复了LR阴茎健康缺欠。种植的素加工处理测试反映，vik-2变动体对种植的素诱惑的LR阴茎健康想法下降，反映VIK在种植的素调节功能LR阴茎健康中产生核心功能。 
图7 VIK 在LR建立历程中可以磷过酸和安全LBD18蛋清
PART 02 散文总结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷碱化淀粉酶质组学研究分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的发育素数据信息调高侧根成型
PART 03 拜谱工作小结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的血清质组学、遮盖血清质组学、细胞代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—极高程度DIA·磷硝化作用绘制组，采用创新丰度技术设备+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现动物界样表10w+、绿植样表5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参阅文献资料：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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